受理号：CSZ1900183

体外诊断试剂产品注册技术审评报告

产品中文名称：幽门螺杆菌 23S rRNA 基因与 gyrA 基因突变检测试剂盒（荧光 PCR 法）

产品管理类别：第三类

申请人名称：江苏默乐生物科技股份有限公司

国家药品监督管理局

医疗器械技术审评中心

基本信息

一、申请人名称

江苏默乐生物科技股份有限公司

二、申请人住所

江苏省泰州市健康大道 805 号 G116 幢 6F-7F 东

三、生产地址

泰州市药城大道 G02 厂房，R19 楼；江苏省泰州市健康大道 805 号 G116 幢 6F、7F 东

技术审评概述

一、产品概述

（一）产品主要组成成分

检测缓冲液、引物探针、混合酶液、强阳性质控品、弱阳性质控品、阴性质控品。（具体详见说明书）

（二）产品预期用途

用于检测人胃黏膜组织样本中幽门螺杆菌 23S rRNA 基因A2143G、A2143C 和 A2144G 突变和 gyrA 基因 261A、261G、260T、271A、271T、272G 突变。

本试剂盒用于幽门螺杆菌克拉霉素耐药（23S rRNA 基因突变）和喹诺酮类抗生素耐药（gyrA 基因突变）的临床辅助诊断，为临床医生评估个体中幽门螺杆菌的耐药性提供参考。试剂盒适用于幽门螺杆菌感染者且临床认为有必要采用胃粘膜组织进行幽门螺杆菌耐药诊断的患者。未与具体药品进行相关临床试验，本试剂盒检测结果仅供临床参考，不得作为确诊或排除的唯一依据。

（三）产品包装规格

50 测试/盒

（四）产品检验原理

采用聚合酶链式反应（PCR）结合Taqman荧光探针技术对人胃黏膜组织样本中的幽门螺杆菌及耐药突变的鉴别检测。针对幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因（23S rRNA基因）与喹诺酮类抗生素耐药基因（gyrA基因）的突变位点设计引物探针，采用FAM荧光标记克拉霉素耐药基因突变，采用HEX荧光标记喹诺酮类抗生素耐药基因突变。包含与克拉霉素耐药相关的23SrRNA基因的3种突变和与喹诺酮类抗生素耐药相关的gyrA基因的6种突变

二、临床前研究概述

（一）主要原材料

本产品的主要原材料包括：引物、探针、HS Taq DNA 聚合酶、UNG 酶、dNTPs、质粒等，这些原材料均通过外购的方式获得。引物和探针均由申请人自行设计后，由专业的合成公司合成。申请人对主要原材料进行了供应商的选择，通过功能性实验筛选出合格供应商，制定了各主要原材料的技术要求和质量标准并经检验合格。

企业参考品设置情况：申请人设计了完整的企业参考品，包括阳性参考品、阴性参考品、最低检测限参考品、精密度参考品以及突变检测限参考品。企业参考品的主要原料为幽门螺杆菌菌液、临床样本核酸、质粒等。参考品组成如下：

Hp 阳性参考品 10 份；Hp 阴性参考品 10 份；包含所有位点的最低检测限参考品 30 份；Hp 精密度参考品 1 份；突变检测限参考品 18 份。以上企业参考品均含有一定浓度的人类基因组DNA 作为内标。

企业参考品 所采 用临床样 本采 用基因测序的方法进行确认。企业参考品用于产品特异性、灵敏度、最低检测限、精密度及突变检测限检测。

（二）生产工艺及反应体系研究

申请人根据试剂盒中试剂及成分的主要生产工艺研究结果，确定了最佳的生产工艺。试剂盒反应体系的研究中，包含了临床样本的核酸提取与 PCR 扩增反应等。其中核酸提取研究包括核酸纯度、核酸完整性、重复性以及取样部位、取样大小等。PCR 扩增的反应体系研究包括引物探针浓度、dNTPs 浓度、DNA 聚合酶浓度、镁离子浓度、BSA 浓度、丙三醇浓度以及PCR反应程序优化等。通过一系列功能性实验，最终确定了最佳的反应体系。

（三）分析性能评估

该产品分析性能包括灵敏度、准确度、特异性（交叉反应、干扰物质）、精密度等。此外，还研究了配套使用的核酸提取试剂的性能。申请人提交了有效运行的质量管理体系下生产的 三 批产品在适用机型 ABI7500 荧光 PCR 仪与上海宏石SLAN-96P 上进行的性能评估资料。

在灵敏度的性能评估中，进行了最低检测限与突变率检测限的确定和验证。

最低检测限的确定和验证：申请人采用临床样本培养物对每个突变位点分别建立检出限。选取分别具有 23S rRNA 基因2143C、2143G 和 2144G，gyrA 基因 261G、261A、260T、271A、271T 和 272G 突变的菌液，每种突变菌株分别稀释至不同浓度，使用 3 批试剂对每一浓度重复检测 20 次，以此确定试剂盒的最低检出限，结果显示：具有 95%以上阳性检出率的样本浓度均不高于 1×104copies/mL。申请人进一步选取 10 例具有不同突变类型的临床培养物，并使用幽门螺杆菌阴性样本稀释至1×104copies/mL，在稀释物中添加不同干扰物质后再检测，结果显示，在存在干扰物质的情况下，试剂盒的最低检出限仍然为1×104copies/mL。

突变检测限的确定和验证：申请人将不同浓度、具有不同突变类型的核酸与野生核酸按照不同比例进行混合。核酸浓度为 1pg/μL 时，设置突变比例分别为 10%、0.1%和 0.001%，浓度为 0.001pg/μL 时，设置突变比例为 80%、50%和 10%。每种混合核酸均进行 20 次重复，结果显示，当野生型幽门螺杆菌浓度为 1pg/μL，各突变位点具有 90%以上阳性检出率的最低突变比例为 0.1%；当野生幽门螺杆菌浓度为 0.001pg/μL，各突变位点具有 90%以上阳性检出率的最低占比为 50%。申请人进一步将经测序方法验证过的、具有不同突变类型的核酸与野生型核酸混合按照一定比例混合后进行检测，用以验证突变检测限。

结果显示：当野生型幽门螺杆菌浓度为 1pg/μL，0.1%突变比例条件下，各突变位点均能 100%检出；当野生幽门螺杆菌浓度为0.001pg/μL，50%突变比例条件下，各突变位点均能 100%检出。在准确度的性能评估中，使用 3 批试剂对企业阳性参考品和阴性参考品进行检测。检测结果表明，阳性符合率和阴性符合率均为 100%。

在交叉反应的性能评估中，使用 3 批试剂检测胃肠道常见的其他病原微生物，如蜡样芽孢杆菌、肺炎克雷伯杆菌肺炎、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、类志贺邻单胞菌、流感嗜血杆菌、副溶血性弧菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、脑膜炎奈瑟菌、结核分枝杆菌、大肠杆菌、空肠弯曲菌、变形杆菌、白色念珠菌、粪肠球菌等，检测结果均为阴性。

在干扰物质的性能评估中，采用向弱阳性样本中加入干扰物质的方法进行验证，实验结果显示，常见干扰物质如血红蛋白（1000.0 mg/L）、粘蛋白（2000.0 mg/L）、白细胞（109个/L）、阿莫西林（0.75mg/L）、克拉霉素（0.29mg/L）、左氧氟沙星（1.62mg/L）、四环素（5.0mg/L）、甲硝唑（40.0mg/L）、奥美拉唑（0.4mg/L）、雷贝拉唑（0.802mg/L）、兰索拉唑（1.15mg/L）、泮托拉唑（3.81mg/L）、枸橼酸铋钾（67.85mg/L）、阿司匹林（ 300.0mg/L ）、 对 乙 酰 氨 基 酚 （ 13.824mg/L ）、 铝 碳 酸 镁（1500.0mg/L）、乳酸菌素（3600.0mg/L）和胃康灵（100.0mg/L）等在上述浓度时对本试剂的检测结果没有影响。

在精密度的性能评估中，选择 10 例具有不同突变类型的样本，并稀释至不同浓度，在 20 天内，每天由 2 人分别进行 2个轮次的检测，每一次检测做 3 个重复。检测结果显示：批内、批间、日内、日间、仪器间以及操作者间的变异系数 CV 均小于 5%。

本次申报产品包括 1 种包装规格（50 测试/盒），2 种实时荧光定量 PCR 仪适用机型（ABI7500 与上海宏石 SLAN-96P），申请人提供了三批产品在适用机型上的性能评估资料。

（四）阳性判断值研究

申请人选取胃粘膜组织临床样本，包含 23S rRNA 基因2143C/2143G/2144G 和 gyrA 基因 261G/261A/260T/271A/271T/272G 不同突变的样本，对检测结果进行 ROC 曲线分析，结果显示：幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因突变检测 FAM 荧光 Ct 值的参考值为 35.04；幽门螺杆菌喹诺酮类抗生素耐药基因突变HEX 荧光 Ct 值的参考值为 35.73。本试剂盒使用人源基因作为试剂盒内标，确定内标 CY5 荧光 Ct 值的参考值为 32.00。同时，将本试剂盒检测结果进一步与临床培养药敏实验结果进行了比较，验证了试剂阳性判断值的合理性。

（五）稳定性研究

申请人对本产品的实时稳定性、运输稳定性、开瓶稳定性、冻融稳定性、胃黏膜组织样本的稳定性以及核酸的稳定性进行了研究，确定了在各种条件下本产品及样本的有效保存时间。

实时稳定性的研究：采用三批试剂进行研究，将本试剂盒避光密闭保存在-20±5℃条件下，分别在第 0、1、2、3、6、9、12、13 月取出检测，检测的样本类型包括阳性参考品、阴性参考品、检测限参考品、精密度参考品等企业参考品，以从准确度、特异性、检测限、精密度等方面综合验证试剂盒的稳定程度。检测结果表明，各项性能指标均符合要求，确定产品在规定的储存条件下，可稳定保存 12 个月。

此外，申请人对产品的运输稳定性、开瓶稳定性、冻融稳定性、样本及核酸稳定性分别进行了研究。结果显示，产品的性能均满足产品说明书的声称。

三、临床评价概述

申请人在南昌大学第一附属医院、南方医科大学南方医院、湖州市中心医院、山西省人民医院和四川大学华西医院共 5 家临床试验机构完成了临床试验。

临床试验主要包括两部分内容：第一部分，采用试验用体外诊断试剂与幽门螺杆菌克拉霉素和喹诺酮类抗生素体外药敏实验（E-test）进行比较研究，共计入组 801 例幽门螺杆菌感染受试者样本（幽门螺杆菌培养阳性），其中药敏实验检出克拉霉素耐药菌株 562 例，克拉霉素敏感菌株 239 例，研究结果显示，试验用体外诊断试剂临床灵敏度是 91.81%（95%CI: 89.25%～93.81%），临床特异度是 80.33%（95%CI：74.83%～84.88%）。药敏实验检出喹诺酮类抗生素耐药菌株 532 例，喹诺酮类抗生素敏感菌株 269 例，试验用体外诊断试剂临床灵敏度是 84.96%（95%CI：81.67%～87.75%），临床特异度是 82.16%（95%CI：77.14%～86.27%）。试验还对所有突变位点进行了单独统计，各位点与药敏结果符合率良好，且满足统计学意义。

第二部分，采用试验用体外诊断试剂与 Sanger 测序法进行对比试验。共计入组样本 1786 例，其中，测序检出 23S rRNA基因的 3 种常见突变阳性 813 例，突变阴性 973 例，两种方法的阳性符合率为 94.10%（95%CI：92.26%～95.52%），阴性符合率为 96.71%（95%CI：95.39%～97.66%），总符合率为 95.52%（95%CI：94.46%～96.39%）；测序检出 gyrA 基因的 6 种常见突变阳性 675 例，突变阴性 1111 例，两种方法的阳性符合率为93.48%（95%CI：91.36%～95.11%)，阴性符合率为 94.42%（95%CI：92.91%～95.62%），总符合率为 94.06%（95%CI：92.87%～95.07%）。考核试剂与 Sanger 测序法一致性良好。

综上，临床试验结果显示，本产品检测结果用于幽门螺杆菌克拉霉素和喹诺酮类抗生素耐药的辅助诊断，灵敏度、特异度良好，基本满足临床需求。

四、产品受益风险判定

（一）受益评估

目前认为幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是引起慢性活动性胃炎、十二指肠及胃溃疡的主要原因。另外，根据目前多方面流行病学调查显示，发现 Hp 除了与上消化道的慢性炎症、消化道溃疡、胃癌等疾病高度相关以外，同时与许多胃肠外疾病的发生、发展有相当密切的关系。

目前对幽门螺杆菌的治疗主要采用含有抗生素的三联或四联疗法进行，而随着抗生素的大量使用，幽门螺杆菌已经出现了抗生素的耐药现象，克拉霉素与喹诺酮类抗生素耐药率在20%-50%之间。《第五次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告》中指出：不论初次治疗或补救治疗，如需选择含克拉霉素、甲硝唑或左氧氟沙星的三联方案，应进行药物敏感试验。有研究表明，基于药敏试验的多重疗法相比于经验性的用药，Hp 的根除率从 63%提高至 86%，但培养有一定技术要求，敏感性偏低，因此不推荐单纯用于 Hp 感染的常规诊断。我国《第五次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告》指出：分子生物学可用于 Hp 耐药位点的检测，并明确认为该方法学对 Hp 耐药基因突变的检测具有临床应用价值。

本试剂检测幽门螺杆菌感染患者胃粘膜组织样本中的幽门螺杆菌 23S rRNA 基因两个多态性位点的三种常见突变 2143C、2143G 和 2144G，gyrA 基因 6 种常见突变 261G、261A、260T、271A、271T 和 272G。用于幽门螺杆菌克拉霉素和喹诺酮类抗生素耐药的临床辅助诊断，为临床医生评估个体中幽门螺杆菌的耐药特性提供参考。临床应用的主要受益在于：对于幽门螺杆菌感染者需要进行克拉霉素和喹诺酮类抗生素药物敏感性评价的，提供除细菌药敏试验外的一种分子生物学方法的选择。特别是可以弥补幽门螺杆菌培养敏感性不足的问题。幽门螺杆菌阳性可以及时治疗，耐药阳性患者可以避免使用克拉霉素或喹诺酮类抗生素治疗导致的失败，从而提高幽门螺杆菌的根除率。经临床评价，该产品对克拉霉素耐药幽门螺杆菌菌株感染患者的检出灵敏度是 94.10%，对喹诺酮类抗生素耐药幽门螺杆菌菌株感染患者的检出灵敏度是 93.48%。

（二）风险评估

该产品主要的风险来自于检测存在假阴性情况，如对克拉霉素耐药幽门螺杆菌菌株感染患者检测结果为阴性，则可能导致患者使用克拉霉素进行治疗，进一步导致治疗失败，经临床研究，本检测假阴性的概率是 5.90%。如对喹诺酮类抗生素幽门螺杆菌菌株感染患者检测结果为阴性，则可能导致患者使用喹诺酮类抗生素进行治疗，进一步导致治疗失败，经临床研究，本检测假阴性的概率是 6.52%。

（三）风险收益评价结论

根据申请人提供的申报资料，经综合评价，在目前认知水平上，认为该产品能够较大程度地满足医疗需求，预期为适用人群带来的受益大于风险。但为保证用械安全，基于对主要剩余风险的规避，需在说明书中提示以下信息：采用本试剂盒进行检验得到的结果仅供临床参考，不作为治疗或其它临床管理的唯一依据。

综合评价意见

本申报项目为境内第三类医疗器械产品注册，属于境内同品种首个产品。申请人的注册申报资料符合现行要求，依据《医疗器械监督管理条例》（国务院令第 680 号）、《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令 2014 年第 5 号）等相关医疗器械法规与配套规章，经系统评价后，建议准予注册。

2022 年 1 月 24 日