引言：感染性疾病诊断市场在IVD行业一直是最大的细分市场，感染性疾病的诊断技术也一直在不停发展，从最早的培养法，到血液学分析、特定蛋白检测、免疫学抗原抗体检测，再到病原体质谱和核酸分析，手段越来越精准，让人眼花缭乱。如何从众多技术中洞察未来发展趋势，找准最大的风口，请跟随我一起，来一场感染性疾病诊断技术的旅行吧！

 

人类发展进程中，感染性疾病一直是严重威胁人类健康的重大疾病，历史上传染病大爆发有过多次记载：霍乱、欧洲鼠疫（黑死病）、西班牙大流感等等，大瘟疫流行期间，最多杀死过1/3人口（欧洲中世纪大瘟疫死亡2500万人）。
今年年初由新型冠状病毒引发的瘟疫，截止目前（2020.3.3）感染人数超8万人，死亡超3000人，也会被载入人类史册。
以往传染病的大爆发，因为没有及时的隔离措施（主要靠事后将尸体焚烧）、有效的传染病病原体鉴定技术以及良好医学治疗手段的支撑，传染人数和死亡数都非常可怕，现代社会管理体系，在以上三方面都有了长足的进步，从武汉1.23封城到疫情控制，基本只用了1个月，新发病例急剧减少，这一个月内，诊断产品快速研制、药物快速筛选和试错，都为瘟疫控制起到了极大的作用。
笔者近十年一直从事体外诊断IVD行业，现尝试对感染性疾病的诊断技术进行一次概括，以期让大家对感染性疾病诊断有一次全面的了解，因为能力有限，一家之言，肯定偏跛，有兴趣的朋友欢迎探讨。 感染性疾病目前诊断技术手段主要有：培养、免疫学检测、核酸检测、质谱法。
1、培养
培养技术主要是将人体的血液以及其他体液（尿液、胸腹水、痰液、脑脊液、脓液等等）接种到特制培养基或活体上进行微生物培养，一直是感染性疾病诊断的“金标准”，但这个“金标准”因为培养周期长效率低、培养阳性率或成功率有限、容易引入杂菌或定植菌等因素，逐渐受到其他诊断技术的挑战，后面会对其他三种临床上常用的诊断技术进行分别叙述。
培养技术的发展方向，基本就是朝着自动化发展，自动化培养/接种/划线、自动化鉴定与药敏试验、自动化染色，减少人工操作负担和误差。
这里再补充一点，做微生物显微镜检，目前很多医院还在经常使用，直接肉眼观测来判断。

 2、免疫学检测 

免疫学检测，主要是利用高特异性的抗原抗体反应以及高灵敏度的分子信标来检测样本中的待测物。感染性疾病中，病原体侵袭人体，突破机体非特异性的第一道防线和第二道防线后，最终被具有特异性的第三道防线——免疫系统所识别。病原体自身的蛋白、核酸或磷脂等物质会刺激人体免疫系统产生特异性抗体，同时病原体自身物质也会微量残留在机体内，通过检测病人血样或其他样本中的病原体抗体或抗原，来判断病原体的存在。

近50年来，免疫诊断技术有了长足的发展，开发出了以上图示常见免疫学诊断技术。
目前主流技术是化学发光免疫分析，因其自动化程度高、检测结果准确、灵敏度高而受到临床及检验领域的广泛使用和认可，也是目前IVD行业最热门、竞争最激烈、市场份额占比最大、利润最高的细分市场。
如此众多的免疫学检测技术，区别主要在于检测结果的准确度和灵敏度。

新兴的单分子免疫分析技术，检测灵敏度可以达到fg/ml（1fg=10^-15g）左右，也在逐渐走入大家的视野。通常来说，一个灵敏度更高的技术出现，往往会推动科研学术界发现新的biomarker（生物标志物），疾病诊断的参考依据也会更加多样化和精准，整个IVD市场蛋糕也会被做大。

除了准确度灵敏度，免疫检测还有重要突破点，那就是多重检测。
常规免疫检测，都是单指标检测，也就一个测试只能检测一个指标。这种效率非常低，设备检测通量基本受制于机械机构设计。流式荧光法和数码液相芯片的出现能大大提高检测通量：
1. 流式荧光法，典型代表是美国Luminex，2000年就崭露头角了，作为平台型技术，可以开发免疫和分子相关的检测指标。在免疫方面，通过编码微球技术，Luminex可以最多同时检测100个指标，120样本/h的处理速度，可以达到12000测试/h的检测通量。
2. 数码液相芯片技术，典型代表是美国Applied Biocode，将半导体光刻技术应用到IVD领域，通过光刻法将12位二进制数字条码刻到磁珠上（上图所示），这种工艺可以制备出4096种（2¹²=4096）不同编码的数码磁珠，每种编码也就意味着一种指标，而且可以同时检测免疫和分子指标。 免疫学诊断技术在感染性疾病的使用已经很普遍了，因为操作相对简便，日常检测比核酸手段更加常见，例如常说的术前八项（HBV HCV HIV TP），还有其他呼吸道感染病原体（流感 肺支 肺衣 合胞 腺病毒等），通过检测抗体或抗体即可进行初步诊断。 实验室诊断技术包括免疫诊断的发展方向，主要在两个：
1. 自动化：所有手工或半自动设备，将往自动化方向发展，例如分子诊断，然后实现流水线作业，并最终实现全实验室自动化（total laboratory automation，TLA）和无人化。该方向业内有些专家提出了质疑，TLA会不会反而降低部分指标TAT；还有人提出“水果篮理论”，会不会因为利益关系，而降低了实验室整体的质量。
2. 便捷小型化：例如血气或微型化学发光或分子POCT，实现POCT全场景即时检测，脱离中心实验。首要是便捷，其次才是体积，POCT核心并不是小，而是便捷，这是常见的误区。 
这两个方向存在的问题：

1. 自动化方向，人口增长及老年化带来的样本量急剧增高，医院大楼不可能一直扩建，实验室空间也很难继续扩大，在实验室设备人满为患的当下，加之很多产品（例如生化仪器、化学发光分析仪）的单通道检测通量已经达到极限，如何满足未来检测量的需求，怎么进一步提高实验室的通量，已经成为摆在检验界同行面前的一个现实问题。

2. 小型化方向，设备小型化最常用的开发思路就是将大型设备的功能或参数下调，例如减少样本位和试剂位、降低温控系统的体积、减少运动部件使用，甚至在操作自动化、性能指标上降低要求，看似达到了小型化目的，但也带来了客户操作体验或产品性能的下滑，这是绝对不可取的，而且不要忽视了POCT产品本身也有通量需求。出现以上问题，原因在于机械结构设计的局限性，而要解决这个问题，必须要重新思考技术实现形式，幸运的是，新的技术实现形式涌现出来，其中以微流控技术为主要代表。
鉴于以上思考，笔者认为，这种两极分化的发展方向，在本质上是一致的：在保证性能的前提下，提高实验室单位空间（或者单位占地面积）的通量。
同时，笔者提出2个关键指标：博德致远系数B（比通量）=T/V，博德致远系数B2（坪效）=T/S，T为通量throughput，V为空间volume，S为占地面积square，这是业内首次提出该概念。
  3、质谱技术
质谱（Mass Spectrometry，MS）技术是一种谱学分析方法，它是通过制备、分离、检测气相离子来推测、鉴定和定量分析化合物的一门技术，核心原理是不同质量的离子具有不同的质荷比（m/z），在磁场和电场中，离子发生速度色散和质量分离。所谓谱学分析，除了质谱，还有光谱、色谱和波谱。
质谱技术，可以根据离子源和质量分析器来进行组合分类。
离子源主要有：电子电离EI、化学电离源（Chemical Ionization，CI）、快原子轰击（FAB）、电喷雾（ESI）和基质辅助激光解吸（MALDI）等，后面两个促进了质谱在生物大分子分析领域的应用，2002年J.B.Penn和田中耕一因ESI质谱和MALDI质谱获诺贝尔化学奖。
质量分析器主要有：四极杆Quad、离子阱ionTrap、飞行时间TOF、双聚焦、傅立叶变换。
另外，质谱技术常需要搭配色谱技术，本质上是一种层析技术，利用不同样品与固定相和流动相之间的相对移动力差别，在两相中进行多次平衡，从而达到对样品的相互分离。
常用色谱主要有：（1）气相色谱GC（2）液相色谱LC或高效液相色谱HPLC（3）毛细管电泳CE（4）超临界流体色谱SFC等等。根据色谱和质量分析器也能对质谱技术进行组合分类，例如：LC-MS、GC-MS等。

质谱在临床上的应用，主要有：新生儿遗传代谢疾病筛查、药物浓度检测、维生素检测、激素类检测、肿瘤标志物筛选、微生物鉴定和核酸分析等。其中基质辅助激光解吸飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of -flight massspectrometry，MALDI-TOF MS）目前越来越多用于微生物鉴定和核酸分析工作。该技术对样品纯度要求不高，可以直接使用临床样本，或者经过分离培养挑选单菌落进行检测，获得其蛋白质谱图，与更新的微生物数据库参考图谱进行比对，从而鉴定至属、种、乃至亚种的水平，缩短了鉴定的时间。对临床常见的隐球菌鉴定，MALDI-TOF MS也表现了极好的鉴定能力。
临床质谱的发展方向，笔者个人认为：（1）进一步降低质谱设备成本（2）提高自动化程度和降低实验室条件要求（3）提高检测通量（4）方法学需要标准化（5）加强微生物数据库建设

 4、核酸检测 

核酸检测，包括核酸分子杂交、核酸扩增技术、基因芯片、测序技术等技术。利用核酸检测感染性疾病中的病原体微生物已经在临床、疾控、环境等领域广泛使用，任何生物（朊病毒除外，这是一个奇葩特例）都含有特异的核酸，通过核酸分析技术，可以直接得出样品中微生物的存在。

其中核酸分子杂交包括膜上印记扎染、荧光原位杂交、芯片杂交、RNA酶保护分析法、核酸酶S1保护分析。
核酸扩增技术，按照扩增反应温度是否变化，分为PCR变温扩增技术和恒温扩增技术。其中，PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）技术根据定性或定量能力分为：普通PCR定性技术、荧光qPCR定量技术和数字dPCR绝对定量技术。
PCR技术的发明绝对是人类生物学研究的一大里程碑事件，直接促成了分子生物学的迅猛发展，仅次于沃森和克里克对DNA双螺旋的发现，DNA双螺旋发现是直接开创了分子生物学。
这样一个godkiller技术的发明过程也是颇具传奇色彩：1983年嗑药后飙车的老司机Kary Mullis大神在幻觉下爆发出来的灵感，最终通过实验尝试并证明可行性。PCR专利一经公布，并火遍全球，对人类分子生物学的研究起到了极大推动作用。（这个PCR专利建议每一个从事生物研究的人都学习下）。关于PCR技术的进一步发展，笔者还想提下另一位大神，美国犹他大学的Carl Wittwer教授，后面会介绍他的贡献。
PCR属于底层原理技术，专利壁垒极高，根本无法绕开。同时，PCR技术需要经过变性、退火和延伸三个步骤，三个步骤均在不同温度下进行（见上图，后来经过酶改造，退火和延伸的温度可以统一），温度控制要求也就比较高。基于以上原因（主要还是专利原因），就有学者们发明了与PCR这种变温核酸扩增技术相对应的恒温扩增技术（Isothermal amplificationtechnology，IAT）。
恒温扩增技术也有各种流派，常见的有：LAMP环介导等温扩增、RPA重组酶聚合酶扩增（有公司也叫RAA技术）、RCA滚环扩增、SDA酶促DNA体外等温扩增方法、CRP交叉引物恒温扩增技术、TMA转录介导核酸扩增、NASBA基于核酸序列扩增、SAT实时荧光恒温扩增检测等等。
另外，还需要提及一种技术，branch DNA信号放大技术（见上图）。PCR和IAT技术都是将核酸进行扩增，通过染料或探针的信号增强来提高核酸检测灵敏度，而branchDNA技术不将核酸进行扩增，而是直接通过将单靶标分子的信号直接放大，无需抽提纯化RNA，无需反转录，无需PCR扩增，只要将样本用特定裂解液裂解后，经探针杂交与信号放大后即可迅速得到基因定量结果。
基因芯片是利用基因微阵列技术，将特异的寡核苷酸片段以高密度排列在片基上，与目的片段进行识别和杂交，通过特定的检测系统和分析系统进行结果解读，可实现多靶标多种病原体微生物的同时检测。
测序技术根据先进程度分为一代测序（sanger测序）、二代测序（即NGS，illumina和Thermo为主的高通量大规模平行测序）、三代测序（PacBio公司的SMRT、Oxford Nanopore Technologies的纳米孔单分子测序技术），在读长上，三代测序可以达到几十kb，远超二代测序技术，未来潜力巨大。
NGS用于感染性疾病是最近几年兴起的，因为测序会测出样本中所有的微生物，而不是像PCR那样单一靶标，所以被称为mNGS（meta-genomicsNGS）宏基因组学分析，这项技术最大的优势是解决PCR检测靶标相对单一的问题，可以检出未知病原体。
在此，让我们来回顾下mNGS技术在本次新冠疫情中的使用。

基因编辑技术是近些年异常火爆的生物技术，尤其是经过南方科大贺建奎胚胎编辑事件后，为社会大众广泛认知。
基因编辑技术主要由两位大神发现：麻省理工学院-哈佛大学Broad研究所张锋研究员、加州大学伯克利分校Jennifer Doudna教授。
这两位大神后来分别成立了Sherlock Biosciences和Mammoth Biosciences公司，利用基因编辑技术，通过gRNA靶向和Cas酶的定向剪切，实现核酸靶向检测，可在试纸条上显色直接肉眼观测，在第三世界国家传染病防控和治疗上有一定价值。

具体实验操作，以张锋团队新冠病毒检测试剂盒为例：
大致步骤就是：RNA提取纯化、RPA扩增、Cas13酶切、显色判别。未来有可能做到免提取，只需要一个恒温水浴锅即可，这样才能真正满足第三世界的条件要求。 
5、四种技术在感染性疾病诊断中的使用比较
笔者先为大家鼓个掌，你们能坚持看到这里，一定程度说明了你们对技术的热爱和好奇。同时，大家心里可能也一直有个疑问，这些技术之间有什么差别，我应该怎么选择呢？
从多方面综合考虑，核酸检测是最优方案，培养是最普及方案，免疫学和质谱可作为辅助手段联合使用。
 6、不同核酸分析技术的比较
核酸检测（即分子诊断）在感染性疾病的诊断中，经过分析是最优方案，一旦解决了核酸检测现状，就会全面普及，市场开始爆发。但是核酸检测的不同技术也有差别，请看下表。
笔者认为，每种技术均有优势与局限性，所以使用场景的选择和市场定位就显得尤为重要。
常规操作PCR是最优选项，IAT因为性能问题可以作为备选方案，可用于宠物医疗和食品环境检测；基因芯片有一定价值，但开发难度、成本和性能上还需要提高；mNGS使用场景相对受限，属于ICU危重症病人采用PCR有限病原体排查后仍然无法确诊的最后方案。

 7、核酸分析未来的发展方向

 笔者认为，PCR作为最成熟的分子诊断技术，还有很广阔的开发空间，伴随精准诊断的意识觉醒，分子诊断市场将迎来爆发增长。

上图是笔者关于诊断技术与产品的发展方向的判断，一家之言，现对各方面逐一讲解。
1. 全自动和全集成：现有市场上的PCR仪器，本质上是一个精密温控和光学检测设备，而PCR仪器检测的核酸样品，还需要经过上游的样本裂解处理和核酸提取纯化过程。传统PCR实验操作，分别在四个独立实验室内部操作，以防止样本间的核酸污染，见下图。
全集成是指四步操作能在一台设备内全部完成，而全自动是指能在一台设备内完全自动完成，中间无需人工操作或干预。
IVD其他领域全自动都已经实现，例如血球、凝血、生化、免疫等，唯独分子诊断因为技术门槛还未完全实现和普及。市面上已经出现了两种全自动解决方案：全自动核酸一体化分析工作站、全自动微流控核酸分析系统。
全自动核酸工作站，不同于其他IVD全自动设备，核酸分析因为过于灵敏，对样本交叉污染和气溶胶污染是零容忍的，所以除了高难度的机械结构设计，还对气流控制和模块封闭性有很高的要求，这进一步加大了研发门槛。另外工作站的采购成本也很高，也限制了医院的使用。当然这种产品在疾病爆发阶段（例如本次新冠疫情）能发挥更大的作用。
另一种解决方案——全自动微流控核酸分析系统——则能更好的满足当下的医院检测需求，利用先进的微纳制造技术，将PCR实验每一步操作集成在微流控装置内（产品形式有：芯片、卡盒、离心盘），实现全自动一体化核酸分析。 2. 全封闭：如果能做到全自动和全集成操作，核酸如果能全流程在一个封闭体系内，无需开盖，样本不会与空气有任何接触，这样才会真正解决样本间的核酸污染和气溶胶问题。这方面目前只有微流控技术能实现，微流控技术将试剂各组分内置在芯片或卡盒内部，操作时，仅需将样本加入到微流控芯片或卡盒预设的加样孔，然后封闭加样孔、上机检测即可。 3. 快速：PCR需要通过控制温度来实现核酸变性、退火和延伸步骤，三个步骤为一个循环（cycle），结束后核酸数量放大一倍（即扩增一倍），通常PCR反应需要30~40个cycle。目前常规PCR扩增耗时一般需要1~2小时，快的能达到30min，这只是扩增检测步骤，还不包括前面的样本处理和提取。
PCR扩增速度与温控模块的升降温速度和精度有很大关系，而升降温速度和精度与PCR反应体系的体积也成负相关，PCR反应体积越小，升降温能更快，精度更高。
目前全球PCR研究结果显示，PCR能实现最快0.4s/cycle，20s内完成整个PCR反应，这个成果由世界知名PCR专家美国University of Utah大学Carl.Wittwer教授发明。Carl Wittwer教授同时是罗氏LightCycle、Biofire Filmarray、快速PCR、极限PCR、熔解分析、HRM分析的发明人，他对PCR技术的发展可以说仅次于PCR技术发明人Kary Mullis，是笔者最为钦佩的人之一。

微流控技术因为反应体系小，从而可以实现更快的扩增速度。

 4. 多重和超多重：多重检测是指一个反应体系内能同时扩增检测的靶标数量。对于感染性疾病，因为我们并不知道病人感染了哪种病原体，如果采用传统单靶标PCR试剂盒，每次只能检测一种靶标，若检测为阴性，则需要更换检测其他靶标的PCR试剂盒，这样效率就大大降低，异常盲目，俗称“大海捞针”。要做到更快确诊、鉴别诊断和排除诊断，就要设计多重检测技术。

据统计，90%感染性疾病基本由50种左右病原体微生物导致，所以检测50个靶标能解决临床诊断的大部分问题，省下的10%就交给mNGS，这也是从卫生经济学上来考虑的。 5. 高通量：除了以上要求，检测设备在样本检测通量上也应该有一定要求，来满足医院日益增加的核酸检测需求。